Skp2

Jun 19, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 805 (2023) Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Nichtkleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist die häufigste Krebsart und die häufigste krebsbedingte Todesursache. Chemotherapeutische Resistenzen sind ein großes Hindernis bei der Behandlung von NSCLC-Patienten. Hier entdeckten wir, dass die E3-Ligase Skp2 überexprimiert wird, was mit einer Herunterregulierung des mit Nekroptose verbundenen Regulators MLKL in menschlichen NSCLC-Geweben und Zelllinien einhergeht. Der Abbau von Skp2 hemmte die Lebensfähigkeit, das verankerungsunabhängige Wachstum und die In-vivo-Tumorentwicklung von NSCLC-Zellen. Wir fanden auch heraus, dass das Skp2-Protein in NSCLC-Geweben negativ mit MLKL korreliert. Darüber hinaus ist Skp2 erhöht und geht mit einer Hochregulierung der Ubiquitinierung und des Abbaus von MLKL in Cisplatin-resistenten NSCLC-Zellen einher. Dementsprechend stellt die Hemmung von Skp2 MLKL teilweise wieder her und sensibilisiert NSCLC-Zellen in vitro und in vivo für Cisplatin. Mechanistisch interagiert Skp2 und fördert den durch Ubiquitinierung vermittelten Abbau von MLKL in Cisplatin-resistenten NSCLC-Zellen. Unsere Ergebnisse liefern Hinweise auf einen Skp2-abhängigen Mechanismus, der den MLKL-Abbau und die Cisplatin-Resistenz reguliert, was darauf hindeutet, dass der gezielte Abbau des Skp2-ubiquitinierten MLKL die NSCLC-Chemoresistenz überwinden kann.

Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC), der die drei wichtigsten histologischen Subtypen Lungenadenokarzinom (LUAD), Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC) und großzelliges Karzinom umfasst, macht etwa 80–85 % aller Lungenkrebserkrankungen aus1 und ist eine der Hauptursachen für Lungenkrebs Krebstodesfälle weltweit2. Mehrere umsetzbare genetische Veränderungen wie EGFR, ALK, ROS1, KRAS, c-MET, RET, NTRK, BRAF und HER2 wurden bei Patienten mit NSCLC festgestellt und können mit Wirkstoffen für gezielte Therapien behandelt werden3,4,5. Allerdings kommt es bei dieser Untergruppe von Patienten im Laufe der Zeit zwangsläufig zu einer Arzneimittelresistenz gegenüber einer gezielten Therapie. Nachdem gezielte Therapien ausgeschöpft sind, kann eine systemische Therapie mit Chemotherapie, wie z. B. einer platinbasierten Chemotherapie, mit oder ohne Einbeziehung einer Immuntherapie unter Verwendung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs), wie z. B. anti-programmierter Zelltod-Proteinligand 1 (anti-PD-L1), anti Als Behandlungsoptionen werden in der Regel programmiertes Zelltodprotein 1 (Anti-PD-1) und antizytotoxische T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (Anti-CTLA-4)-Antikörper im Behandlungsschema angeboten. Darüber hinaus kommt es bei NSCLC-Patienten häufig zu einer Resistenz gegen Platinverbindungen (z. B. Cisplatin und Carboplatin)6. Daher ist es notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen, um die Hindernisse für den klinischen Einsatz von Platinverbindungen zu überwinden und schließlich Krebserkrankungen zu heilen.

Die E3-Ligase Skp2 (S-Phase-Kinase-assoziiertes Protein 2) ist ein entscheidender Bestandteil des SCF-Typs (Skp1-Cullin1-F-Box) der E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexe7. Skp2 fungiert als Onkoprotein und übt onkogene Funktionen durch Ubiquitinierung seiner Substrate wie p218, p279, p5710, E-Cadherin11, FOXO112, Akt13, ING314 und andere aus. Daher steuert Skp2 viele kritische zelluläre Prozesse, einschließlich Zellwachstum, Apoptose, Differenzierung, Zellzyklusverlauf, Migration, Invasion und Metastasierung15. Eine hohe Skp2-Expression wurde bei verschiedenen menschlichen Krebserkrankungen15,16, einschließlich NSCLC17,18, festgestellt und ist mit Lymphknotenmetastasen, Gefäßinvasion und einer schlechten Überlebensrate der Patienten verbunden. Darüber hinaus hat Skp2 Berichten zufolge bei verschiedenen Krebsarten beim Menschen eine Arzneimittelresistenz entwickelt19. Es wurde gezeigt, dass eine fehlerhafte Regulation von Skp2 mit einer Rapamycin-Resistenz in verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien zusammenhängt20. Skp2 ist mit einer Resistenz gegen präoperative Doxorubicin-basierte Chemotherapie21, Paclitaxel19 und Gefitinib22-Resistenz verbunden. Ein hoher Skp2-Spiegel verleiht Nasopharynxkarzinomzellen23 und Mantelzelllymphomzellen24 eine Cisplatinresistenz. Berichten zufolge erhöhte die Hochregulierung von Skp2 die Cisplatin-Resistenz in A549-Zellen25. Allerdings ist die Rolle von Skp2 bei der Cisplatinresistenz von NSCLC noch nicht vollständig geklärt.

Das MLKL-Gen (Mixed-Lineage Kinase Domain-like) spielt eine entscheidende Rolle bei der Durchführung der Nekroptose26,27,28. Kurz gesagt löst die RIPK3-vermittelte Phosphorylierung von MLKL eine Konformationsänderung aus, die die Translokation zu Zellmembranen und schließlich deren irreversible Zerstörung erleichtert, was schließlich zum nekrotischen Zelltod führt29. Eine geringe Expression des MLKL-Proteins ist mit einem verringerten Gesamtüberleben (OS) bei Patienten mit Pankreas-Adenokarzinom30, Dickdarmkrebs31, Eierstockkrebs32 und NSCLC33 verbunden, was wahrscheinlich auf eine unzureichende MLKL-Nekroptose-Signalübertragung zurückzuführen ist, was darauf hindeutet, dass Nekroptose ein wichtiger Faktor für den Tod und die Ergebnisse von Krebszellen ist diese Patienten. Allerdings sind die relevanten Berichte über den Zusammenhang zwischen MLKL und Chemoresistenz unklar.

Cisplatin ist eines der wirksamsten Chemotherapeutika zur Behandlung von Krebserkrankungen beim Menschen, einschließlich NSCLC34. Leider entwickeln viele Patienten während der Cisplatin-basierten Behandlung eine Arzneimittelresistenz. In dieser Studie haben wir Cisplatin-resistente NSCLC-Zelllinien etabliert und untersucht, ob Skp2 eine entscheidende Rolle bei der NSCLC-Cisplatin-Resistenz spielt. Wir haben Skp2 als eine E3-Ligase identifiziert, die MLKL ubiquitiniert. Die Skp2-regulierte Ubiquitinierung und der Abbau von MLKL tragen zumindest teilweise zur Cisplatinresistenz in NSCLC-Zellen bei. Die genetische oder pharmakologische Inaktivierung von Skp2 sensibilisiert die Cisplatin-resistenten NSCLC-Zellen erneut für die Cisplatin-Behandlung, was darauf hindeutet, dass die MLKL-Ubiquitinierung durch Skp2 ein potenzielles therapeutisches Ziel zur Überwindung der NSCLC-Chemoresistenz darstellt.

Wir untersuchten zunächst den Proteingehalt von Skp2 durch Western Blot in immortalisierten Nicht-Tumorzellen HBE und MRC5 und einer Reihe menschlicher NSCLC-Zelllinien. Das Ergebnis zeigte, dass Skp2 mit Ausnahme der H460- und H358-Zellen in fast allen getesteten menschlichen NSCLC-Zelllinien stark exprimiert wurde (Abb. 1a, b). Wir haben außerdem die Skp2-Spiegel in den NSCLC-Geweben bestimmt und benachbarte Nicht-Tumor-Gewebe gepaart. Die Daten zeigten, dass die Expression von Skp2 in NSCLC-Geweben im Vergleich zu den angrenzenden Geweben signifikant erhöht ist (Abb. 1c, d, Ergänzungstabelle 1). Um die Wirkung von Skp2 auf die Proliferation von NSCLC-Zellen zu beurteilen, haben wir die stabilen Skp2-Knockdown-Zelllinien H1299, H23, H125 und A549 generiert und shRNAs validiert, die die Skp2-Expression nach der Transfektion wirksam abschwächten (Abb. 1e). Im Vergleich zur shGFP-Kontrolle hemmte der Abbau von Skp2 die Zellproliferation (Abb. 1f) und das verankerungsunabhängige Zellwachstum (Abb. 1g) dieser Zelllinien. Um die Rolle von Skp2 bei der Tumorentstehung von NSCLC in vivo zu bestimmen, führten wir athymische Nacktmausmodelle durch. Wir fanden heraus, dass die Hemmung der Skp2-Expression das Tumorwachstum im H23-Xenotransplantatmodell signifikant unterdrückte (Abb. 1h – j). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Skp2 eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von NSCLC-Tumoren spielt und dass der Abbau von Skp2 in NSCLC-Zellen die tumorigenen Eigenschaften verringert.

Eine Western-Blot-Analyse untersuchte die Skp2- und MLKL-Expression in mehreren NSCLC-Zelllinien, der menschlichen normalen Lungenfibroblasten-Zelllinie MRC5 und der immortalisierten menschlichen Bronchialepithelzelllinie HBE. Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet. b Streudiagramm zeigt eine negative Korrelation zwischen der Expression von Skp2 und MLKL in menschlichen NSCLC-Zelllinien. Zur Beurteilung der statistischen Signifikanz wurden Pearson-Koeffiziententests durchgeführt. c Die Skp2- und MLKL-Proteinspiegel in sechs repräsentativen NSCLC-Fällen wurden durch Western-Blot-Analyse bestimmt. β-Actin wurde als Ladungskontrolle verwendet (linkes Feld). N: angrenzendes Nichttumorgewebe; T, Tumor. Durch Western Blot wurden die Skp2- (mittleres Feld) und MLKL-Proteinniveaus (rechtes Feld) im bösartigen und den entsprechenden normalen angrenzenden Geweben von 22 NSCLC-Patienten bestimmt. Die Intensität wurde mit der Computersoftware Image J (NIH) bewertet. N = 22, **p < 0,01, ***p < 0,001 nach Student-t-Test, signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wie angegeben. d Repräsentative Bilder der immunhistochemischen Färbung für Skp2 und MLKL repräsentieren Proben von 39 Fällen von menschlichem NSCLC (linkes Feld). IHC-Scores für Skp2 (mittleres Feld) und MLKL (rechtes Feld) in 39 gepaarten Tumoren und angrenzenden Geweben. N = 39, ***p < 0,001 gemäß Mann-Whitney-U-Test. z. B. Knockdown von Skp2 (e), abgeschwächter Zellproliferation von NCI-H1299, NCI-H23, NCI-H125 und A549 (n = 3) (f) und verankerungsunabhängigem Zellwachstum in Weichagar (n = 3) (g) . Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. **p < 0,01, ***p < 0,001 nach Student-t-Test, signifikanter Unterschied im Vergleich zu den shGFP-Kontrollzellen. h–j Der Abbau von Skp2 unterdrückt das Tumorwachstum in vivo. Gezeigt wurden das durchschnittliche Tumorvolumen (h), fotografierte Xenotransplantattumoren (i) und das durchschnittliche Tumorgewicht (j) von H23-shGFP- und H23-shSkp2-Xenotransplantaten. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD angezeigt. N = 5 Mäuse pro Gruppe, ***p < 0,001 nach Student-t-Test, signifikanter Unterschied im Vergleich zur shGFP-Kontrollgruppe.

Wir fanden heraus, dass NSCLC-Zellen mit höherem Skp2 einen geringeren MLKL exprimierten, wohingegen NSCLC-Zellen mit niedrigerem Skp2 einen höheren MLKL aufwiesen (Abb. 1a, b). Skp2 und MLKL zeigten in NSCLC-Zelllinien entgegengesetzte Expressionsniveaus. Wie durch Immunhistochemie festgestellt wurde, wurde in den meisten Fällen bei reduziertem MLKL-Protein konsistent ein auffälliger Zusammenhang mit erhöhten Skp2-Spiegeln beobachtet und die Expression von MLKL ist in den NSCLC-Geweben im Vergleich zu den angrenzenden Geweben signifikant verringert (Abb. 1c, d, Ergänzung). Tabelle 2). Das Skp2-Expressionsniveau korrelierte umgekehrt mit MLKL in klinischen NSCLC-Proben (Abb. 2a – d). Um unsere Beobachtungen weiter auf einen klinisch-pathologisch relevanten Kontext auszuweiten, führten wir eine Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von Skp2 und MLKL bei 813 NSCLC-Patienten durch. Die Ergebnisse zeigten, dass eine hohe Skp2-mRNA-Expression mit einem schlechteren Gesamtüberleben (OS) verbunden war. Im Gegenteil, eine hohe MLKL-mRNA-Expression war signifikant mit einer günstigen Prognose verbunden (Abb. 2e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Skp2 die MLKL-Proteinspiegel negativ reguliert und legen nahe, dass MLKL ein neues Substrat von Skp2 ist. Die Skp2-MLKL-Achse spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von NSCLC und korreliert mit der Prognose von Patienten mit NSCLC.

a Repräsentative Fälle von 39 NSCLC-Proben wurden durch IHC-Färbung mit Skp2 und MLKL analysiert. b Der Prozentsatz der Proben mit niedriger oder hoher Skp2-Expression im Vergleich zu den Expressionsniveaus von MLKL. N = 39. c Die relativen Anteile der Proteinexpressionen wurden als Kreisdiagramm dargestellt. d Streudiagramm zeigte eine negative Korrelation zwischen Skp2 und MLKL. e Kaplan-Meier-Analyse, die die Korrelation zwischen Skp2- oder MLKL-Expressionsniveaus und dem Gesamtüberleben (OS) von Patienten (n = 813) mit NSCLC zeigt. Die Genexpressionsdaten und Überlebensinformationen wurden aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank heruntergeladen, einschließlich der Datensätze GSE29013, GSE37745, GSE31210 und GSE157011, basierend auf der GPL570-Plattform. Die Diagramme wurden mit der R-Software gezeichnet. p < 0,05 laut Log-Rank-Test (Mantel-Cox) wurde als statistisch signifikanter Unterschied angesehen.

Um festzustellen, ob Skp2 den Proteinspiegel von MLKL direkt reguliert, wurden 293T-Zellen vorübergehend mit Skp2 und MLKL co-transfiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Koexpression von Skp2 MLKL dosisabhängig verringerte (Abb. 3a). Darüber hinaus führte die ektopisch zunehmende Skp2-Expression auch zu einer Verringerung der endogenen MLKL-Spiegel (Abb. 3b) sowohl in H358- als auch in H460-Zellen mit relativ wenig nachweisbarem Skp2-Protein, aber einem hohen MLKL-Spiegel (Abb. 1a). Diese Ergebnisse zeigten, dass Skp2 das MLKL-Protein dosisabhängig exogen und endogen reduziert. Der Abbau von Skp2 durch shRNA erhöhte das endogene MLKL-Protein, begleitet von einer Erhöhung des p27-Proteins, einem bekannten Skp2-Substrat, in H1299-, A549- und H23-Zellen (Abb. 3c). Der Skp2-Inhibitor SZL P1-41, der die Aktivität der Skp2-E3-Ligase, jedoch nicht die Aktivität anderer SCF-Komplexe selektiv unterdrückt, führte zur Akkumulation von MLKL und p27 in A549- und H1299-Zellen (Abb. 3d – f). Bemerkenswerterweise war der MLKL-mRNA-Spiegel nach dem Abbau von Skp2 mit dem in Kontrollzellen vergleichbar (Abb. 3g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Skp2 die MLKL-Häufigkeit zumindest teilweise durch posttranslationale Modifikationen reguliert.

a Vorübergehende Expression des Skp2-reduzierten Flag-MLKL-Proteins. 293T-Zellen wurden wie angegeben mit den Konstrukten cotransfiziert. Ganzzellextrakte (WCEs) wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. b Eine Überexpression von Skp2 verringert den endogenen MLKL-Proteinspiegel. H358- und H460-NSCLC-Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen des Skp2-Expressionskonstrukts kotransfiziert, WCEs wurden einer Western-Blot-Analyse auf den endogenen MLKL-Proteingehalt unterzogen. c Der Abbau von Skp2 führte zu einem erhöhten Spiegel an endogenem MLKL-Protein. Stabiler Abbau von endogenem Skp2 durch shRNA in H1299-, A549- und H23-NSCLC-Zellen, WCEs wurden für die Western-Blot-Analyse vorbereitet. d–f Die pharmakologische Hemmung von Skp2 erhöhte den MLKL-Proteinspiegel. A549- und H1299-Zellen wurden 24 Stunden lang mit den angegebenen Dosen des Skp2-Inhibitors SZL P1-41 behandelt, WCEs wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Die Intensität wurde mit der Computersoftware Image J (NIH) bewertet (e, f). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. ns, statistisch nicht signifikant. *p < 0,05, **p < 0,01 durch 1-fach ANOVA-Test mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest, signifikanter Unterschied im Vergleich zur DMSO-behandelten Gruppe. Die g-MLKL-mRNA-Expression in Skp2-stummschaltenden NSCLC-Zellen wurde mittels RT-qPCR untersucht. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. ns nach Student-t-Test, statistisch nicht signifikant.

Als nächstes beurteilten wir durch Co-Immunpräzipitationstests, ob Skp2 mit MLKL interagiert. GFP-markierte MLKL- und Flag-markierte Skp2-Expressionsvektoren wurden entweder einzeln oder zusammen in 293T-Zellen transfiziert und eine Co-Immunpräzipitation wurde unter Verwendung eines Anti-Flag- oder Anti-GFP-Antikörpers durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Flag-Skp2 in den GFP-MLKL-Immunpräzipitationen nachgewiesen wurde (Abb. 4a). GFP-MLKL wurde auch im Flag-Skp2-Immunkomplex gefunden (Abb. 4b). Anschließend wollten wir herausfinden, ob endogenes MLKL mit Skp2 in H1299-Zellen interagiert. MLKL und Skp2 wurden getrennt aus H1299-Zellen immunpräzipitiert und das reziproke Protein wurde durch Western Blot nachgewiesen. Wie in Abb. 4c, d gezeigt, wurden sowohl Skp2 als auch MLKL in ihren einzelnen immunpräzipitierten Komplexen nachgewiesen, jedoch nicht in den isotypangepassten Negativkontroll-IgG-Komplexen. Eine endogene MLKL- und Skp2-Wechselwirkung wurde auch in A549-Zellen gefunden (Abb. 4e, f). Darüber hinaus blockierte der Skp2-Inhibitor SZL P1-41 die Skp2-MLKL-Assoziation in A549-Zellen (Abb. 4g). Somit deuten die Ergebnisse darauf hin, dass MLKL und Skp2 sowohl auf exogener als auch auf endogener Ebene physischen Kontakt haben.

a, b Co-Immunpräzipitationsanalyse (Co-IP) der Skp2- und MLKL-Interaktion. 293T-Zellen wurden wie angegeben mit den Konstrukten transfiziert, WCEs wurden einem Co-IP-Assay und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. c, d Co-IP-Analyse der endogenen Skp2- und MLKL-Interaktion in H1299-Zellen. WCEs wurden gesammelt und einem Co-IP-Assay und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. e, f Co-IP-Analyse der endogenen Skp2- und MLKL-Interaktion in A549-Zellen. WCEs wurden gesammelt und einem Co-IP-Assay und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. g A549-Zellen wurden 24 Stunden lang mit der angegebenen Dosis des Skp2-Inhibitors SZL P1-41 behandelt, WCEs wurden einem Co-IP-Assay und einer Western-Blot-Analyse unterzogen.

Nachdem die ektopische Expression von Skp2 die MLKL-Proteinspiegel verringerte (Abb. 3a, b), untersuchten wir, ob Skp2 die MLKL-Stabilität reguliert. Das endogene MLKL-Protein wurde durch Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 in H1299- und H23-Zellen stabilisiert (Abb. 5a, ergänzende Abb. 1a, Spur 1 vs. Spur 3). Die MG132-Behandlung maskierte den Effekt der Skp2-Depletion sowohl in H1299- als auch in H23-Zellen (Abb. 5a, ergänzende Abb. 1a, Spur 2 vs. Spur 4). Die ektopische Skp2-Expression verringerte den endogenen MLKL-Proteinspiegel, der durch Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 in A549-Zellen wiederhergestellt wurde (Abb. 5b). Die Ergebnisse legen nahe, dass MLKL durch das 26S-Proteasom abgebaut wird. Die MLKL-Halbwertszeit wurde mithilfe eines Cycloheximid (CHX)-Chase-Experiments bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Abbau von Skp2 die Halbwertszeit des MLKL-Proteins verlängerte (Abb. 5c, ergänzende Abb. 1b), was darauf hindeutet, dass Skp2 das MLKL-Protein destabilisierte. Da Skp2 eine E3-Ligase für gezielte Proteine ​​ist, die zum proteasomal vermittelten Abbau durch Ubiquitinierung beiträgt, haben wir somit festgestellt, ob MLKL ein Substrat für die Skp2-induzierte Ubiquitinierung ist. Um diese Hypothese zu testen, haben wir 293T-Zellen mit den Plasmiden His-Ub, GFP-MLKL und Flag-Skp2 co-transfiziert und ubiquitiniertes MLKL einer SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung eines Anti-GFP-Antikörpers unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, dass die MLKL-Ubiquitinierung durch Skp2-Überexpression im Vergleich zur Vektorkontrolle zunahm (Abb. 5d), wohingegen die MLKL-Ubiquitinierung durch SZL P1-41-vermittelte Skp2-Hemmung abnahm (Abb. 5d). Durch den Abbau von Skp2 wurde die endogene MLKL-Ubiquitinierung sowohl in H1299- (Abb. 5e) als auch in H23-Zellen (ergänzende Abb. 1c) deutlich abgeschwächt. Diese Beweislinien legen nahe, dass Skp2 MLKL durch Ubiquitin-vermittelten proteasomalen Abbau reguliert.

Eine MLKL-Expression wurde in H1299-Zellen analysiert, die shGFP oder shSkp2 exprimierten, und 12 Stunden lang mit MG132 (20 μM) behandelt. WCEs wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. b Ektopisch exprimiertes Skp2 und 12 Stunden lang in A549-Zellen mit MG132 (20 μM) behandelt. WCEs wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. c H1299-Zellen, die shGFP oder shSkp2 exprimieren, wurden einer Cycloheximid-Chase (25 μg/ml für die angegebenen Zeiten) unterzogen. WCEs wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen (oben) und der Proteingehalt wurde qualifiziert (unten). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. d 293T-Zellen, die mit den angegebenen Plasmiden transfiziert und in Gegenwart von DMSO oder der Verbindung SZL P1-41 (10 μM) 24 Stunden lang kultiviert wurden, dann 6 Stunden lang mit MG132 (20 μM) behandelt, gefolgt von einem In-vivo-MLKL-Ubiquitinierungstest. e Stabile Skp2-Knockdown-H1299-Zellen wurden 6 Stunden lang mit MG132 (20 μM) behandelt, WCEs wurden hergestellt und einer MLKL-Ubiquitinierungsanalyse unter Verwendung eines Ubiquitin-Antikörpers unterzogen.

Angesichts der Regulierung der MLKL-Stabilität durch Skp2 fragten wir, ob die Skp2- und MLKL-Expression in Cisplatin-resistenten Zellen verändert ist. H1299- und A549-Zellen wurden durch kontinuierliche Exposition und allmählich steigende Konzentrationen von Cisplatin über mehr als 6 Monate induziert, um resistente Zellen zu etablieren. Der Zelllebensfähigkeitstest zeigte, dass 20 μM Cisplatin sowohl bei H1299- als auch bei A549-Zellen zu einer Hemmung des Zellwachstums um mehr als 50 % führte. Die Cisplatin-resistenten H1299R- und A549R-Zellen widersetzten sich jedoch den wachstumshemmenden Eigenschaften von 20 μM Cisplatin (Abb. 6a). Offensichtlich war Skp2 in resistenten Zellen im Vergleich zu den Elternzelllinien hochreguliert. Im Gegensatz dazu wurden MLKL, RIP1 und RIP3 herunterreguliert (Abb. 6b). Um festzustellen, ob ein hoher Skp2-Spiegel erforderlich ist, um die Cisplatin-Resistenz aufrechtzuerhalten, wurden Skp2-siRNAs in Cisplatin-resistente H1299R- und A549R-Zellen transfiziert, um die Skp2-Expression zu unterdrücken. Die Ergebnisse zeigten, dass die siRNA-vermittelte Skp2-Depletion mit einem erhöhten MLKL-Protein sowohl in H1299R- als auch in A549R-Zellen einherging (Abb. 6c). Cisplatin schwächte die Lebensfähigkeit der Zellen in den H1299- und A549-Elternzellen unabhängig vom Skp2-Status erheblich ab. Die signifikante Hemmwirkung wurde jedoch nur bei Skp2-Knockdown beobachtet, nicht jedoch bei siCtrl-H1299R- (Abb. 6d) und siCtrl-A549R-Zellen (Abb. 6e). Bei akuter Exposition gegenüber Cisplatin ging der Rückgang des Skp2-Proteinspiegels mit einem leichten Anstieg des MLKL-Proteinspiegels in den A549-Elternzellen einher, wohingegen sich der Skp2- und MLKL-Proteinspiegel in A549R-Zellen offensichtlich nicht veränderte (ergänzende Abbildung 2). Wir untersuchten auch die endogene MLKL- und Skp2-Wechselwirkung in Gegenwart/Abwesenheit von Cisplatin über Co-IP sowohl in A549R- als auch in A549-Zellen. Die endogene Assoziation zwischen MLKL und Skp2 war sowohl in A549R- als auch in A549-Zellen, die mit Cisplatin behandelt wurden, verringert (Abb. 6f, g). Darüber hinaus steigerte die ektopische MLKL-Expression die Cisplatin-reduzierte Zelllebensfähigkeit sowohl in H1299R- als auch in A549R-Zellen (Abb. 6h, i). Um festzustellen, ob die Chemoresistenz mit einer Skp2-vermittelten MLKL-Herunterregulierung in NSCLC-Zellen zusammenhängt, untersuchten wir die Wirksamkeit des Skp2-Inhibitors SZL P1-41 bei der Aufhebung der Cisplatinresistenz. Obwohl Cisplatin und SZL P1-41 allein die Lebensfähigkeit der Zellen in H1299R- und A549R-Zellen teilweise verringerten, verstärkte die Kombinationstherapie die Antitumorwirkung (Abb. 6j, k). Die Ergebnisse zeigten, dass die genetische oder pharmakologische Wiederherstellung von MLKL die Cisplatinresistenz in NSCLC-Zellen abschwächt. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die Überexpression von Skp2 die Ubiquitinierung und den Abbau von MLKL vermittelt, die an der Cisplatinresistenz bei NSCLC beteiligt sind.

a Vergleich der Proliferationshemmungsrate von H1299/H1299R- und A549/A549R-Zellen bei den angegebenen Cisplatin-Konzentrationen für 72 Stunden. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. p < 0,001 nach Student-t-Test. b Die Western-Blot-Analyse zeigte den Proteingehalt von Skp2, MLKL, RIP1 und RIP3 in etablierten Cisplatin-resistenten (H1299R und A549R) Zellen und Elternzellen (H1299 und A549). c–e Die Stummschaltung von Skp2 erhöht die Empfindlichkeit von Cisplatin-resistenten NSCLC-Zellen gegenüber Cisplatin. Die Kontroll- oder Skp2-siRNA wurde 72 Stunden lang vorübergehend in H1299R- und A549R-Zellen transfiziert. Der Abbau von Skp2 wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt (c). Die Elternzellen (H1299 und A549) und Cisplatin-resistenten Zellen (H1299R und A549R) wurden 24 Stunden lang vorübergehend mit der Kontroll- oder Skp2-siRNA transfiziert, trypsinisiert und 48 Stunden lang auf eine 96-Well-Platte ohne oder mit Cisplatin (20 μM) übertragen h, gefolgt von einem Zelllebensfähigkeitstest (d, e). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. ***, p < 0,001 durch 1-fach-ANOVA-Test mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest, signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wie angegeben. f, g Die Cisplatin-resistenten A549R- (f) und parentalen A549-Zellen (g) wurden 48 Stunden lang ohne/mit Cisplatin (20 μM) behandelt, WCEs wurden gesammelt und einem Co-IP-Assay und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. h, i Ektopisch exprimiertes MLKL nach Cisplatin-Behandlung und Durchführung von Zelllebensfähigkeitstests in H1299R- und A549R-Zellen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. ***p < 0,001 laut Student-t-Test, signifikanter Unterschied im Vergleich zur mit Cisplatin behandelten Vektor-transfizierten Gruppe. j, k H1299R- und A549R-Zellen, die 48 Stunden lang mit der Vehikelkontrolle, Cisplatin (20 μM), dem Skp2-Inhibitor SZL P1-41 (10 μM) oder einer Kombination aus Cisplatin und SZL P1-41 behandelt wurden, gefolgt von Zelllebensfähigkeitstests. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. **p < 0,01, ***p < 0,001 durch 1-fach ANOVA-Test mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest, signifikanter Unterschied im Vergleich zur mit Cisplatin behandelten Gruppe oder der mit SZL P1-41 behandelten Gruppe.

Da die Hochregulierung von Skp2 mit einer Herunterregulierung der Nekroptose-bezogenen Regulatoren MLKL, RIP1 und RIP3 in Cisplatin-resistenten H1299R- und A549R-Zellen einherging (Abb. 6b), untersuchten wir den Ubiquitinierungsstatus von MLKL in Cisplatin-resistenten Zellen weiter. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zu den A549-Elternzellen ein signifikanter Anstieg der MLKL-Ubiquitinierung in Cisplatin-resistenten A549R-Zellen zu verzeichnen war (Abb. 7a). Bemerkenswerterweise beeinträchtigte die Vorbehandlung mit dem Nekroptosehemmer Necrostatin-1 (Nec-1) die Cisplatin-reduzierte Zelllebensfähigkeit in Skp2-Knockdown- (Abb. 7b) und SZL P1-41-behandelten (Abb. 7c) A549R-Zellen erheblich, was auf eine Nekroptose schließen lässt könnte an der Resistenz von NSCLC-Zellen gegen Cisplatin beteiligt sein. Das WB-Ergebnis zeigte, dass Nec-1 die Phosphorylierung von RIPK1 an Ser166 in A549-Zellen signifikant aufhob, was darauf hinweist, dass Nec-1 ordnungsgemäß funktioniert (ergänzende Abbildung 3). Darüber hinaus beeinträchtigte der vorübergehende Abbau von MLKL durch siRNA die Cisplatin-reduzierte Zelllebensfähigkeit sowohl in H1299R-shSkp2- als auch in A549R-shSkp2-stabilen Zellen, was die entscheidende Rolle von MLKL bei der Cisplatin-Resistenz bei NSCLC bestätigt (Abb. 7d, e). Xenotransplantattumoren, die aus mit Cisplatin behandelten Skp2-Knockdown-A549R-Zellen stammten, zeigten im Vergleich zu Tumoren, die aus mit Cisplatin behandelten shGFP-A549R-Zellen stammten, eine signifikante Abnahme von Wachstum und Gewicht (Abb. 7f – h). Die IHC-Daten zeigten, dass Xenotransplantattumoren aus mit Cisplatin behandelten Skp2-Knockdown-A549R-Zellen im Vergleich zu mit Cisplatin behandelten Zellen eine signifikante Abnahme des Proteingehalts von Skp2, Ki67 und eine Erhöhung des MLKL-Proteins und der Phosphorylierung bei Thr357 aufwiesen, was für die Nekroptose entscheidend ist36 shGFP-A549R-Xenotransplantattumoren (Abb. 7i, j). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass der Skp2-ubiquitinierte MLKL-Abbau eine entscheidende Rolle bei der Cisplatin-Resistenz spielt und dass die Kombination von Cisplatin mit Skp2-Inhibitoren eine vielversprechende Strategie zur Überwindung der Chemoresistenz in NSCLC-Zellen sein könnte.

a Die parentalen A549-Zellen und Cisplatin-resistenten A549R-Zellen wurden 6 Stunden lang mit MG132 behandelt, WCEs wurden hergestellt und einer MLKL-Ubiquitinierungsanalyse unterzogen. b Cisplatin-resistente A549R-stabile Zellen wurden 1 Stunde lang mit 50 μM Necrostatin-1 vorbehandelt und dann 48 Stunden lang mit DMSO oder Cisplatin (20 μM) behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. ***p < 0,001 nach Student-t-Test. c Cisplatin-resistente A549R-Zellen wurden 1 Stunde lang mit 50 μM Necrostatin-1 vorbehandelt und dann 48 Stunden lang mit DMSO, Cisplatin (20 μM), SZL P1-41 (10 μM) oder einer Kombination aus Cisplatin und SZL P1-41 behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. ***, p < 0,001 nach Student-t-Test. d, e H1299R-shSkp2- und A549R-shSkp2-stabile Zellen wurden MLKL durch siRNA nach ohne/mit Cisplatin-Behandlung vorübergehend eliminiert und Zelllebensfähigkeitstests durchgeführt. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. **p < 0,01, ***p < 0,001 nach Student-t-Test, signifikanter Unterschied im Vergleich zu den mit Cisplatin behandelten Skp2-Knockdown-Zellen. f–h Tumorentstehung von Cisplatin-resistenten A549R-stabilen Zellen, behandelt mit Vehikel oder Cisplatin. Das Tumorvolumen wurde aufgezeichnet (f), die Tumorgröße wurde überwacht (g) und die Tumoren wurden gewogen (h). Maßstabsleiste, 1 cm. N = 5 Mäuse pro Gruppe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 1-Wege-ANOVA-Test mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest. i, j IHC-Färbung von Skp2, MLKL, Ki67 und Phospho-MLKL Thr357 in Xenotransplantattumoren aus den mit Vehikel oder Cisplatin behandelten stabilen shGFP-A549R- und shSkp2-A549R-Zellen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. Maßstabsbalken, 25 μm. ***p < 0,001 1-Wege-ANOVA-Test mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest.

Es ist allgemein bekannt, dass Skp2 zur Zerstörung eine vorherige Phosphorylierung seiner Ziele erfordert. Die meisten Skp2-Ziele werden erkannt, wenn sie phosphoryliert sind7. Beispielsweise ist für die Skp2-vermittelte Ubiquitinierung und den Skp2-vermittelten Abbau eine p27-Phosphorylierung an Thr187 durch CDKs37, eine FOXO1-Phosphorylierung an Ser256 durch Akt12 oder eine RASSF1A-Phosphorylierung an Ser203 durch CyclinD-CDK438 erforderlich. Skp2 interagiert und fördert die Ubiquitinierung und Zerstörung von Casein Kinase I (CKI)-phosphoryliertem E-Cadherin. Durch die Mutation der CKI-phosphorylierten Stellen wird die Skp2-vermittelte Ubiquitinierung und der Abbau von E-Cadherin aufgehoben und die Fähigkeit zur Zellmigration erheblich verringert11. Die Phosphorylierung von PDCD4 auf Ser67 durch Akt ist eine Voraussetzung für die Skp2-regulierte PDCD4-Ubiquitinierung. Auf MLKL wurden mehrere Phosphorylierungsstellen identifiziert, darunter die RIPK3-vermittelte Phosphorylierung auf Ser345, Ser347 und Thr349 bei Mäusen sowie Thr357 und Ser358 beim Menschen26,36,40. Eine weitere Stelle im menschlichen MLKL, die Maus-MLKL Ser124 entspricht, wurde durch eine unbekannte Kinase in zellzyklusabhängiger Weise während des Übergangs von der G1- zur M-Phase phosphoryliert41,42. Darüber hinaus unterliegen Ser228 und Ser248 in Maus-MLKL einer RIPK3-vermittelten Phosphorylierung. Kürzlich wurde festgestellt, dass Mitglieder der TAM-Familie (Tyro3, ​​Axl und Mer) von Rezeptortyrosinkinasen Tyr376 von MLKL unter nekroptotischem Stress phosphorylieren, was die MLKL-Oligomerisierung fördert44. Unser Ergebnis zeigte, dass Skp2 die MLKL-Ubiquitinierung förderte (Abb. 5d) und der Skp2-Inhibitor SZL P1-41 die MLKL-Ubiquitinierung blockierte (Abb. 5d), was darauf hindeutet, dass Skp2 an der Regulierung der MLKL-Polyubiquitinierung beteiligt war. Ob MLKL jedoch eine erforderliche Phosphorylierung durch vorgeschaltete Kinase benötigt und welche Mechanismen der Skp2-Erkennung von MLKL zugrunde liegen, muss jedoch weiter untersucht werden. Darüber hinaus war eine hohe Skp2-mRNA- oder niedrige MLKL-mRNA-Expression in NSCLC-Tumorgeweben laut einer Online-Tool-Analyse mit einem schlechteren Gesamtüberleben (OS) verbunden (Abb. 2e). Obwohl die Integration verschiedener Datensätze die Stichprobengröße erhöhte, stammt der prognostische Wert aus verschiedenen Patientenkohorten mit stark unterschiedlicher Überlebensrate/Genexpression und kann zu einer Verzerrung der Ergebnisse führen. Darüber hinaus sind weitere Belege erforderlich, um den Regulationsmechanismus zwischen ihnen und ihre klinischen Werte in den Proteinspiegeln zu klären, da unsere Ergebnisse darauf hinwiesen, dass Skp2 das MLKL-Protein auf Ubiquitinierungsabhängige Weise reguliert.

Skp2 kann zwei herkömmliche K48- und K63-verknüpfte Polyubiquitinierungsketten an verschiedene Ziele konjugieren. Die K48-verknüpfte Ubiquitinierung durch Skp2 reguliert die Proteinstabilität und führt zu einer Proteasom-vermittelten Proteolyse gezielter Proteine. Beispielsweise induziert Skp2 die K48-verknüpfte Polyubiquitinierung von p2745, FOXO112, mH2A146 und PDCD439, gefolgt von einem Proteasom-vermittelten Abbau. Darüber hinaus vermittelt das nichtproteolytische Skp2 die K63-verknüpfte Polyubiquitinierung von Substraten, um andere Regulierungsfunktionen auszuüben, einschließlich Transport, subzelluläre Lokalisierung und Kinaseaktivierung. Akt ist ein Skp2-Substrat, das einer K63-verknüpften Polyubiquitinierung unterliegt, was zur Akt-Aktivierung und Membranrekrutierung führt13. Tenascin-C wird von Skp2 K63-ubiquitiniert, insbesondere an K942 und K1882, wodurch seine Erkennung durch p62 und sein selektiver autophagischer Abbau gefördert werden47. Skp2 interagiert direkt mit Aurora B und löst die mit Aurora B K63 verbundene Ubiquitinierung aus, um die Aurora B-Aktivierung bei der Zellmitose und dem Spindelkontrollpunkt zu regulieren . Skp2 interagiert mit NBS1 und löst die K63-verknüpfte Ubiquitinierung von NBS1 während DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) aus, wodurch die Interaktion von NBS1 mit ATM gefördert wird, die für die ATM-Aktivierung als Reaktion auf DNA-Schäden von entscheidender Bedeutung ist49. Neben den oben genannten Substraten induziert Skp2 auch die K63-verknüpfte Ubiquitinierung vieler anderer Substrate, wie Akt13, Twist50, LKB151, YAP52, RagA53, Bcr-Abl39 und MTH154. Unser Ergebnis zeigte, dass Skp2 die MLKL-Ubiquitinierung förderte (Abb. 5d, e, ergänzende Abb. 1c) und das endogene MLKL-Protein durch die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 stabilisiert wurde (Abb. 5a, ergänzende Abb. 1a, Spur 1 vs. Spur 3). Die ektopische Skp2-Expression verringerte den endogenen MLKL-Proteinspiegel, der durch Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 wiederhergestellt wurde (Abb. 5b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass ubiquitiniertes MLKL einem Proteasom-abhängigen Abbau unterliegt. Die K48-verknüpfte Ubiquitinierung ist der am häufigsten vorkommende Ub-Kettentyp, der auf Proteine ​​für den proteasomalen Abbau abzielt. Dennoch zeigte ein früherer Bericht, dass jede nicht mit K63 verknüpfte Ubiquitinierung zum proteasomalen Abbau von Proteinen führen könnte55. Aktuelle Berichte zeigen, dass K6-gebundene56 und K11-gebundene57 Ubiquitinierung zum proteasomalen Abbau von Proteinen führen könnte.

Der Abbau von Skp2 erhöht die Cisplatin-Zytotoxizität in Cisplatin-resistenten Zellen wirksamer, was darauf hindeutet, dass Skp2 wahrscheinlich ein vielversprechenderes Ziel bei der Behandlung von Cisplatin-resistenten Tumorzellen ist24. In ähnlicher Weise erhöhte der Skp2-Mangel die Empfindlichkeit der CRPC-Zellen gegenüber der Behandlung mit Doxorubicin oder Paclitaxel. Darüber hinaus erhöhten Doxorubicin oder Paclitaxel in Verbindung mit der Skp2-Inhibitorverbindung Nr. 25 (SZL P1-41) die Zytotoxizität von CRPC-Zellen erheblich50. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass ein Skp2-Mangel Her2-positive Brustkrebszellen empfindlicher auf die Behandlung mit Herceptin macht und das Überleben Her2-positiver Patientinnen verlängert. Dies unterstreicht, dass Skp2 ein attraktives therapeutisches Ziel für die Kombination mit Herceptin zur Krebsbehandlung ist13. Darüber hinaus sensibilisiert die genetische Ablation oder pharmakologische Inaktivierung von Skp2 die Gefitinib-resistenten NSCLC-Zellen erneut für die Gefitinib-Behandlung und verbessert so das Potenzial des Skp2-Targetings zur Überwindung der Gefitinib-Resistenz bei NSCLS-Patienten22. In Übereinstimmung mit diesen Berichten zeigten unsere Ergebnisse, dass eine signifikante Hemmwirkung von Cisplatin nur bei Skp2-Knockdown beobachtet wurde, nicht jedoch bei Kontroll-Knockdown-H1299R- (Abb. 6d) und A549R-Zellen (Abb. 6e, 7b, 7f – h). Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Abbau von Skp2 die p27-Expression induziert (Abb. 3c). Die M-Phase und die G2-Phase sind die empfindlichsten Stadien gegenüber Strahlentherapie oder DNA-Schäden. Der Abbau von Skp2 induziert die p27-Expression und den Stillstand des Zellzyklus, was die Antitumorwirkung von Cisplatin durch DNA-Schäden verstärken kann. Es wurden Anstrengungen unternommen, neue Inhibitoren auf der Grundlage unterschiedlicher Strategien zu entwickeln, und die Kombination dieser Wirkstoffe mit konventioneller Chemotherapie scheint ein attraktiver Ansatz für die Behandlung chemotherapieresistenter Krebsarten zu sein.

Die onkogene Eigenschaft von Skp2 machte es zu einem attraktiven pharmakologischen Ziel für die Krebsprävention und -behandlung. In den letzten Jahren wurden mehrere spezifische Inhibitoren für Skp2 entwickelt. Es wurde festgestellt, dass SZL-P1 41 physikalisch an Skp2 bindet, wodurch die Bildung des Skp2-SCF-Komplexes verhindert und die Aktivität der Skp2-E3-Ligase gehemmt wird, wodurch das Überleben von Krebszellen sowohl in vitro als auch in vivo unterdrückt wird35. Verbindung A (CdpA) hemmt die Skp2-vermittelte p27-Ubiquitinierung und die Skp2-E3-Ligaseaktivität, indem sie Skp2 aus dem SCF-Komplex ausschließt und so den Stillstand des G1/S-Zellzyklus und die Abtötung von Tumorzellen induziert58. Die Verbindungen NSC689857 und NSC681152 stören die Wechselwirkung zwischen Skp2 und Cks1, wodurch Skp2 daran gehindert wird, Thr187-phosphoryliertes p27 und die anschließende Ubiquitinierung zu erkennen59. Es wurde festgestellt, dass die Verbindung SMIP0004 die Skp2-Expression hemmt und so p27 vor dem Abbau schützt, um die Akkumulation von p27 zu induzieren und schließlich das Wachstum von Prostatakrebszellen zu hemmen und Apoptose auszulösen60. Obwohl die Wirksamkeit dieser Verbindungen bei menschlichem Krebs noch weiter begründet werden muss, ist Skp2 immer noch ein attraktives Ziel für die Krebstherapie. Die Entwicklung eines Skp2-spezifischen Inhibitors mit geringen Nebenwirkungen würde der Krebstherapie zugute kommen.

Die Beeinträchtigung der Zelltodwege oder die Resistenz gegen den Zelltod ist ein Kennzeichen verschiedener Krebsarten und der Hauptgrund für die Chemotherapieresistenz, ein großes Problem bei der aktuellen Krebsbehandlung61. Ebenso wie die Apoptose können Tumorzellen eine Resistenz gegen Nekroptose entwickeln, um das Überleben zu sichern62. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Vorbehandlung mit dem Nekroptosehemmer Necrostatin-1 die Lebensfähigkeit der Cisplatin-reduzierten Zellen in Skp2-Knockdown- (Abb. 7b) und SZL P1-41-behandelten (Abb. 7c) A549R-Zellen erheblich beeinträchtigte, was darauf hindeutet, dass der Nekroptosemechanismus dies könnte an der Resistenz von NSCLC-Zellen gegen Cisplatin beteiligt sein. Daher müssen noch neue Therapien erforscht werden, die den programmierten Zelltod, einschließlich Apoptose und Nekroptose, auslösen. Als Effektor der Nekroptose wird MLKL durch IFNs in Krebszellen transkriptionell hochreguliert, was zu einem höheren MLKL-Spiegel führt, der die Zellen für Nekroptose sensibilisiert63. Die genetische oder pharmakologische Hemmung von MLKL rettet PC-Zellen erheblich vor dem durch BV6, BV6/TNFα oder 2'3'-cGAMP/BV6/zVAD.fmk verursachten Zelltod64,65. Die MLKL-Hochregulierung durch ID1-Überexpression sensibilisiert NSCLC-Zellen für die Gefitinib-Behandlung, indem sie den nekrotischen Zelltod induziert66. Die Hemmung der MLKL-Aktivität durch Nekrosulfonamid (NSA) schwächte den Cisplatin-induzierten Zelltod in Cisplatin-resistenten HepG2/DDP-Zellen, die RIP3 überexprimierten, deutlich ab, was darauf hindeutet, dass MLKL zum durch Cisplatin ausgelösten Zelltod von HepG2/DDP-RIP3 beitrug67. Diese Studien legen nahe, dass eine Änderung des MLKL-Proteinspiegels oder der MLKL-Proteinaktivität wertvoll sein könnte, um Zellen für den nekrotischen Zelltod zu sensibilisieren und die Apoptoseresistenz von Krebszellen zu überwinden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Skp2 in Cisplatin-resistenten H1299R- und A549R-Zellen erhöht war, begleitet von einem verringerten MLKL (Abb. 6b). Ebenso ist Skp2 in Paclitaxel-resistenten Prostatakrebszellen68 und den Proteasom-Inhibitoren Bortezomib, Carfilzomib oder Ixazomib-resistenten multiplen Myelomzellen69 erhöht. Wir haben auch Beweise dafür geliefert, dass Skp2 MLKL durch Ubiquitin-vermittelten proteasomalen Abbau reguliert (Abb. 5, ergänzende Abb. 1), was darauf hindeutet, dass die Hochregulierung von Skp2 zumindest teilweise für die Herunterregulierung von MLKL in NSCLC-Zellen mit erworbener Resistenz gegen Cisplatin verantwortlich ist . Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hochregulierung von Skp2 auch mit einem verringerten RIP1 und RIP3 in Cisplatin-resistenten H1299R- und A549R-Zellen einherging (Abb. 6b). Jüngste Forschungsergebnisse haben ergeben, dass die somatische epigenetische Stummschaltung von RIP3 die Nekroptose inaktiviert und zur Chemoresistenz bei malignen Mesotheliomen beiträgt70. Daher konnten wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass RIP1 und/oder RIP3 durch Skp2 reguliert werden und für die Cisplatin-Resistenz in NSCLC-Zellen verantwortlich sind, und die Mechanismen, die der Regulierung von RIP1 und RIP3 durch Skp2 zugrunde liegen, müssen weiter untersucht werden.

Aktuelle Studien weisen darauf hin, dass MLKL mehreren Formen abbauender und nicht abbauender Ubiquitin-Modifikationen mit unterschiedlichen Auswirkungen auf die Nekroptose unterliegt71,72,73,74. MLKL ist an K51, K77, K172 und K219 K63-ubiquitiniert und erfordert gleichzeitig eine RIPK3-induzierte Phosphorylierung während der Nekroptose und Ubiquitylierung. Die Ubiquitinierung von K219 schützt Mäuse vor durch Nekroptose verursachten Hautschäden und macht Zellen resistent gegen den MLKL-vermittelten Zelltod73. Humanes MLKL K230, das dem murinen MLKL-Rest K219 entspricht, wurde als Ubiquitinierungsstelle beschrieben75. Darüber hinaus erleichtern Proteasom-Inhibitoren Berichten zufolge die Stabilisierung von MLKL, was die mögliche Rolle des Proteasom-vermittelten Abbaus von MLKL72 unterstützt. Interessanterweise kommt es nach seiner Aktivierung und Oligomerisierung zu einer nekroptosespezifischen Multi-Mono-Ubiquitylierung von MLKL71. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Skp2 die MLKL-Stabilität regulierte und die Ubiquitinierung und den Abbau von MLKL über das Proteasom förderte (Abb. 5, ergänzende Abb. 1), was darauf hindeutet, dass Skp2 an der Modifikation von MLKL durch K48-Ubiquitinierung beteiligt ist. Obwohl sich die molekularen Mechanismen und zellulären Konsequenzen der MLKL-Ubiquitinierung allmählich abzeichnen, müssen viele grundlegende Fragen geklärt werden, beispielsweise die E3-Ligasen, die für die MLKL-Mono- oder Polyubiquitinierung verantwortlich sind.

Die vorliegende Studie verbindet Skp2 mit einer Schlüsselkomponente des Nekroptosekomplexes MLKL mit der Cisplatinresistenz bei NSCLC. Die Studie liefert einen Machbarkeitsnachweis für Skp2 als Strategie zur Überwindung therapeutischer Resistenzen und liefert die Begründung für die Entwicklung neuartiger Arzneimittelkombinationen zur Verbesserung der Wirksamkeit von Cisplatin-basierten Therapien bei NSCLC. Zusammenfassend zeigen wir, dass die Skp2-MLKL-Achse möglicherweise zur Cisplatin-Resistenz beiträgt, indem sie den Tod von Krebszellen bei NSCLC hemmt. Unsere Studie liefert überzeugende Beweise dafür, dass die pharmakologische Inaktivierung von Skp2 mit aktuellen Chemotherapeutika ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von NSCLC-Patienten mit fehlgeschlagenen vorherigen Behandlungen ist.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Zweiten Xiangya-Krankenhauses oder der Ethikkommission des Xiangya-Krankenhauses der Central South University, China, genehmigt. Alle Patienten gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Tierversuche wurden vom Medical Research Animal Ethics Committee der Central South University, China, genehmigt. Zur Erfüllung der institutionellen Anforderungen wurden eine ethische Genehmigung und eine Einverständniserklärung eingeholt.

Cisplatin und chemische Reagenzien, einschließlich Tris, NaCl, SDS und DMSO, für die Molekularbiologie und Puffervorbereitung wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Zellkulturmedien und Nahrungsergänzungsmittel stammten von Invitrogen (Grand Island, NY). Der Skp2-Inhibitor SZL P1-41 (#HY-100237) wurde von MedChem Express (Monmouth Junction, NJ) gekauft. Necrostatin-1 (#S8037), Cycloheximide (CHX, #S7418) und MG132 (#S2619) wurden von Selleck (Houston, TX) gekauft. Kontroll-siRNA (#6568), Skp2-siRNA I (#7753) und Skp2-siRNA II (#7756) wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) erworben. MLKL-siRNA (sc-93430) wurde von Santa Cruz (Dallas, TX) gekauft. Antikörper gegen Skp2 (#2652, 1:1000), MLKL (#14993, 1:1000), RIP1 (#3493, 1:1000), Phospho-RIPK1 Ser166 (#44590, 1:1000), RIP3 (#13526, 1:1000), Ubiquitin (#3936, 1:1000) und p27 (#3686, 1:1000) wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) erhalten. Antikörper gegen β-Actin (A5316, 1:10.000), Flag-Tag (F3165, 1:1.000) und Flag-HRP (A8592, 1:10.000) stammten von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Antikörper gegen GFP-Tag (TA150032, 1:1000) wurde von OriGene (Rockville, MD) gekauft. Der MLKL-Antikörper (#GTX107538, 1:1000) stammte von GeneTex (Irvine, CA). Der MLKL-Antikörper (#orb32399, 1:1000) stammte von Biorbyt (St. Louis, MO). RIP3 (NBP1-77299, 1:1000) stammte von Novus Biologicals (Littleton, CO). Phospho-MLKL Thr357 (#MAB9187, 1:1000) stammte von R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). Sekundärantikörper, einschließlich Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Nr. 7074, 1:10.000) und Anti-Maus-IgG-HRP (Nr. 7076, 1:10.000), wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) erworben. Antikörperkonjugate wurden durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht (ECL; Kat.-Nr. 34076, Thermo Fisher, Waltham, MA).

NSCLC-Tumorgewebe und die entsprechenden angrenzenden Nicht-Tumorgewebe für die Western-Blot-Analyse wurden mit schriftlicher Einverständniserklärung von der Abteilung für Thoraxchirurgie des Zweiten Xiangya-Krankenhauses bezogen (n = 22). NSCLC-Tumorgewebe und die entsprechenden nicht an den Tumor angrenzenden Gewebe für die Analyse der immunhistochemischen Färbung (IHC) wurden von der Abteilung für Pathologie des Xiangya-Krankenhauses und des Zweiten Xiangya-Krankenhauses erhalten (n = 39). Alle Proben wurden mit schriftlicher Einverständniserklärung gemäß einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll (2022826) der medizinischen Ethikkommission des Second Xiangya Hospital der Central South University entnommen. Die Diagnose und Klassifizierung der Patienten erfolgte durch die Abteilung für Pathologie des Xiangya-Krankenhauses und des Zweiten Xiangya-Krankenhauses gemäß den Richtlinien der WHO. Alle Patienten erhielten vor der Operation keine Behandlung.

Menschliche NSCLC-Zellen, einschließlich NCI-H23 (CRL-5800TM), NCI-H125 (CRL-5801TM), NCI-H460 (HTB-177TM), NCI-H520 (HTB-182TM), NCI-H1299 (CRL-5803TM), NCI-H358 (CRL-5807TM), NCI-H1650 (CRL-5883TM) und HCC827 (CRL-2868TM) von der American Type Culture Collection (ATCC) wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika, kultiviert die ATCC-Protokolle. Menschliche A549-NSCLC-Zellen, menschliche immortalisierte Bronchialepithelzellen (HBE), menschliche immortalisierte Lungenfibroblasten MRC5 und 293T-Zellen wurden wie zuvor beschrieben kultiviert76,77. Die Zellen wurden vor dem Einfrieren zytogenetisch getestet und authentifiziert. Jedes Fläschchen mit gefrorenen Zellen wurde aufgetaut und zwei Monate lang aufbewahrt (10 Passagen). Um Cisplatin-resistente Zelllinien zu etablieren, wurden H1299- und A549-Zellen durch kontinuierliche Exposition und allmählich steigende Konzentrationen von Cisplatin (anfänglich mit 1 μM bis maximal mit 20 μM) induziert. Die resistenten Zellen wurden über 6 Monate lang kontinuierlich in Medium mit 20 μM Cisplatin gehalten und für nachfolgende Experimente verwendet.

Lentivirus-Plasmide, die pLKO.1-shSkp2 enthalten, wurden von Thermo Scientific erworben. Das pLKO.1-shGFP (Plasmid Nr. 30323), das lentivirale Verpackungsplasmid psPAX2 (Plasmid Nr. 12260) und das Hüllplasmid pMD2.G (Plasmid Nr. 12259) waren auf Addgene (Cambridge, MA) erhältlich. Die Expressionskonstrukte pCMV6-Entry-Skp2 (#RC214001) und pCMV6-Entry-MLKL (#RC213152) wurden von OriGene (Rockville, MD) erworben. Das MLKL-Expressionskonstrukt pEGFP-MLKL wurde von Youbio (Changsha, CN) erworben. Die Generierung der genstabilen Knockdown-Zelllinien NCI-H1299, NCI-H23, NCI-H125 oder A549 erfolgte wie zuvor beschrieben77. Zur vorübergehenden Expression von MLKL oder Skp2 durch Plasmidtransfektion wurden Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen vorübergehend mit 2,0 μg Konstrukt mit Lipofectamine 2000 (Nr. 11668-019, Invitrogen, Carlsbad, CA) für 48 Stunden gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Die RNA-Interferenz wurde wie zuvor beschrieben77 durchgeführt. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten gezüchtet und mit 100 pmol Kontroll-siRNA (#6568), Skp2-siRNA I (#7753), Skp2-siRNA II (#7756) oder siMLKL (sc-93430) unter Verwendung von HiPerFect-Transfektionsreagenz (#301705, Qiagen) für 72 Stunden gemäß den Anweisungen des Herstellers und der Abbau von Skp2 wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt.

Gefrorene Gewebeproben wurden in kleine Stücke geschnitten und in Lysepuffer gelöst, der 50 mM Tris-Cl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 100 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 μg/ml Aprotinin und 2 μg/ml Leupeptin enthielt und 1 % NP-40. Die Proben wurden homogenisiert, beschallt und 30 Minuten auf Eis gehalten. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand zur Immunoblot-Analyse gesammelt. Die kultivierten Zellen wurden geerntet und die Ganzzelllysate hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Assay-Reagenz (Kat.-Nr. 23228, Pierce, Rockford, IL) bestimmt.

RT-qPCR wurde wie zuvor beschrieben78 durchgeführt. Die Primer für MLKL sind wie folgt: Vorwärtssequenz: ttcacccataagccaaggag; Umgekehrte Reihenfolge: cccagaggacgattccaaag. Die Primer für GAPDH sind wie folgt: Vorwärtssequenz: tgttgccatcaatgacccctt; Umgekehrte Reihenfolge: ctccacgacgtactcagcg.

Zellen (2 × 103 pro Vertiefung) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und mit unterschiedlichen Dosen von Verbindungen oder einer DMSO-Kontrolle behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mit dem WST-1-Reagenz (Roche, Mannheim, Deutschland) wie zuvor beschrieben77 untersucht.

Zellen (8 × 103 pro Vertiefung) wurden in Platten mit 6 Vertiefungen mit 0,3 % Basalmedium Eagle-Agar, das 10 % FBS enthielt, ausgesät und kultiviert. Die Kulturen wurden 2 oder 3 Wochen lang in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Die Kolonien wurden wie zuvor beschrieben unter einem Mikroskop gezählt77.

Co-IP-Assays wurden wie zuvor beschrieben76 durchgeführt. Für die Immunpräzipitation wurden Antikörper verwendet: MLKL (#GTX107538A, GeneTex), Skp2 (#2652, Cell Signaling Technology) oder normales Kaninchen-IgG (NI01, Calbiochem). Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE aufgelöst und co-immunpräzipitierte Proteine ​​wurden mit Skp2 (#2652, Cell Signaling Technology) bzw. MLKL (#66675-1-Ig, Proteintech) nachgewiesen. Das VeriBlot for IP Detection Reagent (HRP) (#ab131366, Abcam) wurde verwendet, um Störungen durch denaturierte schwere und leichte IgG-Ketten zu vermeiden.

Die NSCLC-Gewebe und die gepaarten angrenzenden Gewebe wurden fixiert, eingebettet und einer IHC-Analyse unterzogen79 und die Immunreaktionen wurden unabhängig von zwei Pathologen wie zuvor beschrieben23 bewertet.

Für den endogenen Ubiquitinierungsnachweis wurden Zellen geerntet und mit modifiziertem RIPA-Puffer (20 mM NAP, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % Triton, 0,5 % Natriumdesoxycholat und 1 % SDS), ergänzt mit Proteaseinhibitoren und 10 mM N, lysiert -Ethylmaleimid (NEM). Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Lysate 15 Minuten lang bei 95 °C gekocht, mit RIPA-Puffer mit 0,1 % SDS verdünnt und dann bei 4 °C (16000 × g 15 Minuten lang) zentrifugiert. Der Überstand wurde mit spezifischen Antikörpern und Protein-A-Sepharose-Perlen über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen wurden die gebundenen Proteine ​​mit 2 × SDS-Probenladepuffer eluiert und auf einer SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von einem Western-Blot. Für den Nickel-Pulldown-Assay wurden die Zellen pelletiert und mit Lysepuffer (6 M Guanidin-HCl, 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,01 M Tris/HCl, pH 8,0, 5 mM Imidazol und 10 mM β-Mercaptoethanol) ergänzt mit Proteaseinhibitoren und 10 mM N-Ethylmaleimid (NEM). Nach Ultraschallbehandlung und Zentrifugation wurde der Überstand mit 50 ml Ni-NTA-Agarose (QIAGEN Inc, Valencia, CA) 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden mit den folgenden Puffern gewaschen: (1) 6 M Guanidin-HCl, 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,01 M Tris/HCl, pH 8,0, 5 mM Imidazol plus 10 mM β-Mercaptoethanol; (2) 8 M Harnstoff, 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,01 M Tris/HCl, pH 8,0, 10 mM Imidazol, 10 mM β-Mercaptoethanol plus 0,1 % Triton X-100; (3) 8 M Harnstoff, 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,01 M Tris/HCl, pH 6,3, 10 mM β-Mercaptoethanol (Puffer A), 20 mM Imidazol plus 0,2 % Triton X-100, (4) Puffer A mit 10 mM Imidazol plus 0,1 % Triton X-100; (5) Puffer A mit 10 mM Imidazol plus 0,05 % Triton X-100. Nach dem letzten Waschvorgang wurden die Proteine ​​mit einem 2 × SDS-Probenladepuffer, der 200 mM Imidazol enthielt, eluiert und auf einer SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von Western Blot.

Alle Mäuse wurden gemäß den strengen Richtlinien des Medical Research Animal Ethics Committee (20220585) der Central South University, China, gehalten und manipuliert. Zellen (1 × 106) wurden sc in 6 Wochen alte athymische Nacktmäuse (n = 5) an der rechten Flanke injiziert, um das Xenotransplantat-Mausmodell zu erzeugen. Die Tumoren wurden alle 3 Tage mit einer Schieblehre gemessen. Das Tumorvolumen wurde aufgezeichnet und gemäß der folgenden Formel berechnet: Tumorvolumen (mm3) = (Länge × Breite × Breite/2). Die Mäuse wurden bis zum Endpunkt überwacht. Damals wurden Mäuse eingeschläfert und Tumore entfernt.

Statistische Analysen wurden mit dem Statistikpaket SPSS (Version 16.0 für Windows, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) und GraphPad Prism (GraphPad 7.0, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Alle quantitativen Daten werden als Mittelwerte ± SD aus drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden durch den Student-t-Test oder die Varianzanalyse (ANOVA) bewertet, wenn die Daten normalverteilt waren. Der χ²-Test wurde verwendet, um Zusammenhänge zwischen verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern Skp2 und MLKL zu bewerten. Für Korrelationstests wurde die Pearson-Rangkorrelation verwendet. Als Kriterium für die statistische Signifikanz wurde ein Wahrscheinlichkeitswert von p < 0,05 verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Unbeschnittene und unbearbeitete Blot-/Gelbilder sind in der ergänzenden Abbildung 4 verfügbar. Quelldaten sind in den ergänzenden Daten 1 verfügbar.

Fadous-Khalifé, MC et al. Krüppel-ähnlicher Faktor 4: ein neuer potenzieller Biomarker für Lungenkrebs. Mol. Klin. Oncol. 5, 35–40 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Cancer Statistics, 2021. CA Cancer J. Clin. 71, 7–33 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Passaro, A., Jänne, PA, Mok, T. & Peters, S. Überwindung von Therapieresistenzen bei EGFR-mutiertem Lungenkrebs. Nat. Krebs 2, 377–391 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Seegobin, K. et al. Immuntherapie bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs mit anderen umsetzbaren Mutationen als EGFR. Vorderseite. Oncol. 11, 750657 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goldberg, SB, Schlessinger, J., Boyer, JL & Herbst, RS Ein Schritt zur Behandlung von KRAS-mutiertem NSCLC. Lancet Oncol. 14, 3–5 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Li, F. et al. Ein Nuklease-mimetisches Platin-Nanozym induziert die gleichzeitige DNA-Platinierung und oxidative Spaltung, um die Resistenz gegen Krebsmedikamente zu überwinden. Nat. Komm. 13, 7361 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Frescas, D. & Pagano, M. Deregulierte Proteolyse durch die F-Box-Proteine ​​SKP2 und Beta-TrCP: Der Ausschlag für Krebs. Nat. Rev. Krebs. 8, 438–449 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, ZK, Gervais, JL & Zhang, H. Humanes CUL-1 assoziiert mit dem SKP1/SKP2-Komplex und reguliert die Proteine ​​p21 (CIP1/WAF1) und Cyclin D. Proz. Natl Acad Sci USA 95, 11324–11329 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsvetkov, LM, Yeh, KH, Lee, SJ, Sun, H. & Zhang, H. Die Ubiquitinierung und der Abbau von p27(Kip1) werden durch den SCF(Skp2)-Komplex durch phosphoryliertes Thr187 in p27 reguliert. Curr. Biol. 9, 661–S. 664 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kamura, T. et al. Abbau von p57Kip2, vermittelt durch SCFSkp2-abhängige Ubiquitylierung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 100, 10231–10236 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Inuzuka, H. et al. Acetylierungsabhängige Regulierung der Skp2-Funktion. Zelle 150, 179–193 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, H. et al. Skp2 hemmt die Tumorsuppression von FOXO1 durch Ubiquitin-vermittelten Abbau. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 102, 1649–1654 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, CH et al. Die Skp2-SCF-E3-Ligase reguliert die Akt-Ubiquitinierung, die Glykolyse, die Herceptin-Empfindlichkeit und die Tumorentstehung. Zelle 149, 1098–1111 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, G., Wang, Y., Garate, M., Zhou, J. & Li, G. Der Tumorsuppressor ING3 wird durch das SCF(Skp2)-vermittelte Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Oncogene 29, 1498–1508 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, Z. et al. Skp2: ein neues potenzielles therapeutisches Ziel für Prostatakrebs. Biochim. Biophys. Acta 1825, 11–17 (2012).

CAS PubMed Google Scholar

Wang, Z., Liu, P., Inuzuka, H. & Wei, W. Rollen von F-Box-Proteinen bei Krebs. Nat. Rev. Cancer 14, 233–247 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takanami, I. Der prognostische Wert der Überexpression von Skp2-mRNA bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs. Oncol. Rep. 13, 727–731 (2005).

CAS PubMed Google Scholar

Yokoi, S. et al. Die Amplifikation und Überexpression von SKP2 ist mit der Metastasierung von nichtkleinzelligem Lungenkrebs in Lymphknoten verbunden. Bin. J. Pathol. 165, 175–180 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, Q. et al. Der Erwerb des epithelial-mesenchymalen Übergangs ist mit der Skp2-Expression in Paclitaxel-resistenten Brustkrebszellen verbunden. Br. J. Krebs. 110, 1958–1967 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Totary-Jain, H. et al. Rapamycin-Resistenz ist mit einer fehlerhaften Regulation von Skp2 verbunden. Krebs Res. 72, 1836–1843 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davidovich, S., Ben-Izhak, O., Shapira, M., Futerman, B. & Hershko, DD Eine Überexpression von Skp2 ist mit einer Resistenz gegen eine präoperative Doxorubicin-basierte Chemotherapie bei primärem Brustkrebs verbunden. Brustkrebs Res. 10, R63 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, F. et al. Die entscheidende Rolle von AMPK bei der Förderung der Akt-Aktivierung unter Stress, Tumorentstehung und Arzneimittelresistenz. Nat Commun. 9, 4728 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, X. et al. Skp2-vermittelte Ubiquitinierung und mitochondriale Lokalisierung von Akt fördern das Tumorwachstum und die Chemoresistenz gegenüber Cisplatin. Oncogene 38, 7457–7472 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yan, W., Yang, Y. & Yang, W. Die Hemmung der SKP2-Aktivität beeinträchtigte die ATM-vermittelte DNA-Reparatur und erhöhte die Empfindlichkeit von Cisplatin-resistenten Mantelzell-Lymphomzellen. Krebsbiother. Radiopharm. 34, 451–458 (2019).

CAS PubMed Google Scholar

Hou, Q. et al. FAM60A fördert die Cisplatin-Resistenz in Lungenkrebszellen, indem es die SKP2-Expression aktiviert. Anticancer Drugs 31, 776–784 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Murphy, JM et al. Die Pseudokinase MLKL vermittelt die Nekroptose über einen molekularen Schaltmechanismus. Immunität 39, 443–453 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou, H. et al. RIP1/RIP3/MLKL-vermittelte Nekroptose trägt zur Vinblastin-induzierten Myokardschädigung bei. Mol. Zellbiochem. 476, 1233–1243 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Weinlich, R., Oberst, A., Beere, HM & Green, DR Nekroptose in Entwicklung, Entzündung und Krankheit. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 18, 127–136 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, J., Yang, Y., He, W. & Sun, L. Nekrosomen-Kernmaschinerie: MLKL. Zellmol. Lebenswissenschaft. 73, 2153–2163 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Colbert, LE et al. Die pronekrotische Proteinexpression gemischter Kinasedomänen ist ein prognostischer Biomarker bei Patienten mit reseziertem Pankreas-Adenokarzinom im Frühstadium. Krebs. 119, 3148–3155 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, X. et al. Zusammenhang zwischen der Expression von Kinasedomänen-ähnlichen Proteinen gemischter Abstammung und der Prognose bei Patienten mit Dickdarmkrebs. Technol. Krebs Res. Behandeln. 16, 428–434 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

He, L., Peng, K., Liu, Y., Xiong, J. & Zhu, FF Eine geringe Expression des domänenähnlichen Proteins der Mixed-Lineage-Kinase ist mit einer schlechten Prognose bei Patientinnen mit Eierstockkrebs verbunden. Onco zielt auf Ther. 6, 1539–1543 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, JE et al. Expression wichtiger regulatorischer Gene bei Nekroptose und ihre Auswirkung auf die Prognose bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs. J. Cancer 11, 5503–5510 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herbst, RS, Morgensztern, D. & Boshoff, C. Die Biologie und Behandlung von nichtkleinzelligem Lungenkrebs. Natur 553, 446–454 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chan, CH et al. Die pharmakologische Inaktivierung der Skp2 SCF-Ubiquitinligase schränkt die Merkmale von Krebsstammzellen und das Fortschreiten des Krebses ein. Zelle 154, 556–568 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sun, L. et al. Mixed-Lineage-Kinase-Domänen-ähnliches Protein vermittelt die Nekrose-Signalisierung stromabwärts der RIP3-Kinase. Zelle 148, 213–227 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakayama, K. et al. Eine gezielte Störung von Skp2 führt zur Akkumulation von Cyclin E und p27 (Kip1), Polyploidie und Zentrosomenüberduplikation. EMBO J. 19, 2069–2081 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Song, MS et al. Skp2 reguliert die antiproliferative Funktion des Tumorsuppressors RASSF1A über den Ubiquitin-vermittelten Abbau am G1-S-Übergang. Oncogene 27, 3176–3185 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liao, Y. et al. USP10 moduliert die SKP2/Bcr-Abl-Achse durch die Stabilisierung von SKP2 bei chronischer myeloischer Leukämie. Zellentdeckung. 5, 24 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Xie, T. et al. Strukturelle Einblicke in die RIP3-vermittelte nekroptotische Signalübertragung. Cell Rep. 5, 70–78 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dephoure, N. et al. Ein quantitativer Atlas der mitotischen Phosphorylierung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 10762–10767 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daub, H. et al. Die kinaseselektive Anreicherung ermöglicht eine quantitative Phosphoproteomik des Kinoms über den gesamten Zellzyklus hinweg. Mol. Zelle 31, 438–448 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tanzer, MC et al. Die Nekroptose-Signalisierung wird durch Phosphorylierung von MLKL-Resten außerhalb der Aktivierungsschleife der Pseudokinasedomäne gesteuert. Biochem. J. 471, 255–265 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Najafov, A. et al. TAM-Kinasen fördern die Nekroptose, indem sie die Oligomerisierung von MLKL regulieren. Mol. Zelle 75, 457–468.e454 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carrano, AC, Eytan, E., Hershko, A. & Pagano, M. SKP2 ist für den Ubiquitin-vermittelten Abbau des CDK-Inhibitors p27 erforderlich. Nat. Zellbiol. 1, 193–S. 199 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, D. et al. Die Skp2-macroH2A1-CDK8-Achse orchestriert den G2/M-Übergang und die Tumorentstehung. Nat. Komm. Rev. 6, 6641 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, ZL et al. Autophagie-Mangel fördert die Resistenz von dreifach negativem Brustkrebs gegenüber T-Zell-vermittelter Zytotoxizität, indem es den Tenascin-C-Abbau blockiert. Nat. Komm. 11, 3806 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J. et al. Skp2 ist für die Aktivierung von Aurora B bei der Zellmitose und dem Spindelkontrollpunkt erforderlich. Zellzyklus 14, 3877–3884 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J. et al. Die Skp2-E3-Ligase integriert die ATM-Aktivierung und die Reparatur der homologen Rekombination durch Ubiquitinierung von NBS1. Mol. Zelle 46, 351–361 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruan, D. et al. Ein Skp2-Mangel schränkt das Fortschreiten und die Stammzelleigenschaften von kastrationsresistentem Prostatakrebs ein, indem er Twist destabilisiert. Oncogene 36, 4299–4310 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, SW et al. Die Skp2-abhängige Ubiquitinierung und Aktivierung von LKB1 ist für das Überleben von Krebszellen unter Energiestress von wesentlicher Bedeutung. Mol. Zelle 57, 1022–1033 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yao, F. et al. SKP2- und OTUD1-regulierte nicht-proteolytische Ubiquitinierung von YAP fördert die Kernlokalisierung und -aktivität von YAP. Nat Commun. 9, 2269 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jin, G. et al. Skp2-vermittelte RagA-Ubiquitinierung löst eine negative Rückkopplung aus, um eine Aminosäure-abhängige mTORC1-Hyperaktivierung durch Rekrutierung von GATOR1 zu verhindern. Mol. Zelle 58, 989–1000 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, JY et al. Die Skp2-vermittelte Stabilisierung von MTH1 fördert das Überleben von Melanomzellen bei oxidativem Stress. Krebs Res. 77, 6226–6239 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, P. et al. Quantitative Proteomik enthüllt die Funktion unkonventioneller Ubiquitinketten beim proteasomalen Abbau. Zelle 137, 133–145 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuan, Y. et al. Durch die gezielte Behandlung von UBE4A wird das Viperin-Protein im Epithel wiederbelebt, um die antivirale Abwehr des Wirts zu verbessern. Mol. Zelle 77, 734–747.e737 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou, W. et al. Neddylierung E2 UBE2F fördert das Überleben von Lungenkrebszellen durch die Aktivierung von CRL5 zum Abbau von NOXA über die K11-Verknüpfung. Klin. Krebs Res. 23, 1104–1116 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, Q. et al. Das Targeting der p27-E3-Ligase SCF(Skp2) führt zu einem p27- und Skp2-vermittelten Zellzyklusstopp und einer Aktivierung der Autophagie. Blut 111, 4690–4699 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ungermannova, D. et al. Hochdurchsatz-Screening-AlphaScreen-Assay zur Identifizierung niedermolekularer Inhibitoren der Ubiquitin-E3-Ligase SCFSkp2-Cks1. J. Biomol. Bildschirm 18, 910–920 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rico-Bautista, E., Yang, CC, Lu, L., Roth, GP & Wolf, DA Chemisch-genetischer Ansatz zur Wiederherstellung von p27Kip1 enthüllt neue Verbindungen mit antiproliferativer Aktivität in Prostatakrebszellen. BMC Biol. 8, 153 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hanahan, D. & Weinberg, RA Kennzeichen von Krebs: die nächste Generation. Zelle 144, 646–674 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Philipp, S., Sosna, J. & Adam, D. Krebs und Nekroptose: Freund oder Feind? Zellmol. Lebenswissenschaft. 73, 2183–2193 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Knuth, AK et al. Interferone regulieren die MLKL-Expression in Krebszellen transkriptionell hoch. Neoplasia 21, 74–81 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hannes, S., Abhari, BA & Fulda, S. Smac-Mimetikum löst Nekroptose in Pankreaskarzinomzellen aus, wenn die Caspase-Aktivierung blockiert ist. Krebs Lett. 380, 31–38 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hannes, S., Karlowitz, R. & van Wijk, SJL Das Smac-Mimetikum BV6 kooperiert mit STING, um Nekroptose in Apoptose-resistenten Pankreaskarzinomzellen zu induzieren. Zelltod-Dis. 12, 816 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan, HY et al. Die Überexpression von ID1 erhöht die Gefitinib-Empfindlichkeit bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs durch Aktivierung der RIP3/MLKL-abhängigen Nekroptose. Krebs Lett. 475, 109–118 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, B. et al. Die mit dem Rezeptor interagierende Proteinkinase 3 fördert die Cisplatin-induzierte Nekroptose in Apoptose-resistenten HepG2/DDP-Zellen. Neoplasma 66, 694–703 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Byun, WS et al. Ein neuartiges Selenonukleosid unterdrückt das Tumorwachstum, indem es den Skp2-Abbau bei Paclitaxel-resistentem Prostatakrebs angreift. Biochem. Pharmakol. 158, 84–94 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Malek, E. et al. Pharmakogenomik- und chemische Bibliotheksscreenings enthüllen einen neuartigen SCF(SKP2)-Inhibitor, der die Bortezomib-Resistenz beim multiplen Myelom überwindet. Leukämie 31, 645–653 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tan, Y. et al. Die somatische epigenetische Stummschaltung von RIPK3 inaktiviert die Nekroptose und trägt zur Chemoresistenz bei malignen Mesotheliomen bei. Klin. Krebs Res. 27, 1200–1213 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, Z. et al. Die durch Oligomerisierung bedingte Ubiquitylierung von MLKL wirkt der Nekroptose entgegen. EMBO J. 40, e103718 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hildebrand, JM et al. Eine Missense-Mutation in der MLKL-Klammerregion fördert eine tödliche neonatale Entzündung und hämatopoetische Dysfunktion. Nat. Komm. 11, 3150 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garcia, LR et al. Die Ubiquitylierung von MLKL an Lysin 219 reguliert positiv die durch Nekroptose verursachte Gewebeschädigung und die Pathogen-Clearance. Nat. Komm. 12, 3364 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lawlor, KE et al. RIPK3 fördert den Zelltod und die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in Abwesenheit von MLKL. Nat. Komm. 6, 6282 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Akimov, V. et al. UbiSite-Ansatz zur umfassenden Kartierung von Lysin und N-terminalen Ubiquitinierungsstellen. Nat. Struktur. Mol. Biol. 25, 631–640 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, W. et al. Deguelin schwächt die Metastasierung nichtkleinzelliger Lungenkrebszellen durch Hemmung des CtsZ/FAK-Signalwegs ab. Cellular Signaling 50, 131–141 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, W. et al. Die Unterdrückung von Noxa durch Bmi1 trägt zur Deguelin-induzierten Apoptose in nichtkleinzelligen Lungenkrebszellen bei. J Cell Mol Med. 22, 6213–6227 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, H. et al. Ein Chrysin-Derivat unterdrückt das Wachstum von Hautkrebs, indem es Cyclin-abhängige Kinasen hemmt. J. Biol. Chem. 288, 25924–25937 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, F. et al. Deguelin unterdrückt nichtkleinzelligen Lungenkrebs, indem es die EGFR-Signalübertragung hemmt und die durch GSK3 beta/FBW7 vermittelte Mcl-1-Destabilisierung fördert. Zelltod-Dis. 11, 15 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken John Angles (University at Albany, State University of New York) für die redaktionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82073260, 81972837, 82003203, 81572280, 81401548) und der Natural Science Foundation der Provinz Hunan (Grant No. 2021JJ31011, 2021JJ41058, 2019JJ40420) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Huiling Zhou, Li Zhou.

Abteilung für Herz-Kreislauf-Chirurgie, Zweites Xiangya-Krankenhaus der Central South University, Changsha, Hunan, China

Huiling Zhou, Qing Guan, Xuyang Hou, Lijun Liu, Jian Wang und Haidan Liu

Klinisches Zentrum für Gendiagnose und -therapie, Zweites Xiangya-Krankenhaus der Central South University, Changsha, Hunan, China

Huiling Zhou, Qing Guan, Xuyang Hou, Cong Wang, Lijun Liu, Jian Wang und Haidan Liu

Abteilung für Pathologie, Nationales klinisches Forschungszentrum für geriatrische Erkrankungen, Xiangya-Krankenhaus der Central South University, Changsha, Hunan, China

Li Zhou

Medizinische Abteilung, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Xinfang Yu

Abteilung für Radiologie, Drittes Xiangya-Krankenhaus der Central South University, Changsha, Hunan, China

Wei Li

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeption und Design: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ; Entwicklung der Methodik: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ, QG, XYH, CW, LJL, JW; Datenerfassung: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ, QG, XYH, CW, LJL, JW; Analyse und Interpretation von Daten: HDL, WL, XFY; Verfassen, Überprüfen und/oder Überarbeiten des Manuskripts: HDL, WL, XFY; Administrative, technische oder materielle Unterstützung: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ, LJL, JW; Studienaufsicht: HDL, WL, XFY Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Wei Li oder Haidan Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Georgios Giamas und Christina Karlsson-Rosenthal. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhou, H., Zhou, L., Guan, Q. et al. Der Skp2-vermittelte MLKL-Abbau verleiht nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen Cisplatin-Resistenz. Commun Biol 6, 805 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05166-6

Zitat herunterladen

Eingegangen: 29. September 2022

Angenommen: 24. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05166-6

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.